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近日，南海海洋所張長(cháng)生研究員團隊和廈門(mén)大學(xué)王斌舉教授團隊合作在P450酶催化糖肽分子內苯酚偶聯(lián)反應的機制研究方面取得新進(jìn)展，相關(guān)成果“Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C?O Phenol Coupling Reactions”發(fā)表于Journal of the American Chemical Society（《美國化學(xué)會(huì )志》）。南海海洋所博士方春艷、副研究員張麗萍和廈門(mén)大學(xué)博士生汪永超為論文共同第一作者，南海海洋所研究員張長(cháng)生、研究員朱義廣和廈門(mén)大學(xué)教授王斌舉為共同通訊作者。

在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，細胞色素P450酶因其獨特、多樣的催化能力而備受矚目。P450酶催化的分子內C?O和C?C苯酚偶聯(lián)反應在天然產(chǎn)物生物合成中扮演著(zhù)關(guān)鍵角色，廣泛存在于糖肽類(lèi)抗生素如萬(wàn)古霉素和替考拉寧中。雖然糖肽類(lèi)抗生素中多個(gè)催化分子內苯酚偶聯(lián)反應P450酶的功能和晶體結構相繼被解析，但底物復合物結構的缺失導致該類(lèi)反應的催化機制一直是未解之謎。

研究團隊從放線(xiàn)菌Amycolatopsis cihanbeyliensis DSM 45679中發(fā)現了C?O連接的新型雙環(huán)糖肽類(lèi)化合物cihanmycins（CHMs,圖1）。CHM A (1)的結構通過(guò)X-ray單晶衍射確定為雙環(huán)糖肽，包含肉桂?；鶊F和兩個(gè)稀有的D-阿拉伯呋喃糖。研究團隊基于生物信息學(xué)分析和異源表達實(shí)驗，在DSM 45679的基因組中定位了CHM的基因簇，并通過(guò)體內基因敲除和體外生化實(shí)驗證實(shí)了3個(gè)P450酶的功能：Cih26負責肉桂?；鶊F的環(huán)氧化和羥化，Cih32負責三個(gè)氨基酸的羥化，Cih33及其同源蛋白DmlH和EpcH催化分子內C?O苯酚偶聯(lián)反應形成CHM的雙環(huán)骨架（圖1）。

圖1. CHM生物合成中3個(gè)P450酶的功能

為揭示Cih33及其同源蛋白催化C?O苯酚偶聯(lián)反應的機制，研究團隊開(kāi)展了晶體學(xué)研究并解析了DmlH和DmlH?7復合物的晶體結構，首次揭開(kāi)了分子內C?O苯酚偶聯(lián)P450酶與大環(huán)肽結合模式的神秘面紗。同時(shí)，單環(huán)底物7的柔性結構使其N(xiāo)MR信號裂分復雜，難以解析結構，而DmlH?7的結構獲取提供了通過(guò)復合物晶體鑒定小分子結構的經(jīng)典案例。值得注意的是，底物7與DmlH的輔因子血紅素（heme）平面之間有一個(gè)水分子，可能在苯酚偶聯(lián)反應的攫氫過(guò)程中起關(guān)鍵作用。為驗證這一推測，研究團隊開(kāi)展了分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬和量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）計算，揭示了DmlH催化分子內苯酚偶聯(lián)反應由水介導的雙自由基機制（圖2），首次提出了水分子在雙自由基苯酚偶聯(lián)反應中的重要作用。

圖2. 分子內苯酚偶聯(lián)反應由水介導的雙自由基機制（注：“*”為羥化氨基酸，“CM”為肉桂?；鶊F）

此外，基于生信分析，從數據庫中挖掘到81個(gè)含有Cih33同源蛋白的肽類(lèi)基因簇。對這些基因簇的P450酶進(jìn)行系統發(fā)育分析，發(fā)現催化分子內苯酚偶聯(lián)反應的Cih33/DmlH/EpcH和糖肽類(lèi)抗生素的P450酶都聚集在同一分支，表明該分支中的其他P450酶可能具有相似的功能和機制，編碼這些P450酶的基因簇有望產(chǎn)生新穎的雙環(huán)肽類(lèi)化合物。

綜上所述，本研究證實(shí)了雙環(huán)糖肽類(lèi)化合物CHM生物合成中3個(gè)P450酶的功能，并利用酶學(xué)和計算化學(xué)等方法首次揭示了DmlH催化分子內苯酚偶聯(lián)反應由水介導的雙自由基機制，為深入理解P450酶催化的分子內苯酚偶聯(lián)反應提供了新的視角，還為發(fā)現和開(kāi)發(fā)更多新穎的雙環(huán)肽類(lèi)化合物奠定了研究基礎，有望為抗生素研發(fā)提供更多物質(zhì)基礎。

以上研究工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃“合成生物學(xué)”重點(diǎn)專(zhuān)項、國家自然科學(xué)基金委重大項目、中國科學(xué)院王寬誠率先人才計劃、廣東省自然科學(xué)基金等項目資助。

相關(guān)論文信息：Chunyan Fang^?,Liping Zhang^?,Yongchao Wang^?,Weiliang Xiong,Zier Yan,Wenjun Zhang,Qingbo Zhang,Binju Wang*,Yiguang Zhu*,and Changsheng Zhang*. Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C?O Phenol Coupling Reactions. J. Am. Chem. Soc. 2024. DOI: 10.1021/jacs.4c02841.

文章鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c02841